분자생물학실습

분자생물학실습 분자생물학실습.doc 목차 Ⅰ. DNA sub-cloning 1. 첫째 날 -Restriction enzyme 처리 -Gel electrophoresis(전기영동으로 FabG DNA와 pET-14b vector 확인) -Gel purification으로 insert gene 분리 2. 둘째 날 -Ligation (pET-14b + FabG) -Competent Cell 만들기 -Heat-Shock을 이용한 Transformation -LB agar plate에 도말 3. 셋째 날 -Transformant 확인 -LB broth에서 증식시킴 4. 넷째 날 -Plasmid mini-prep -> kit를 이용하여 DNA를 얻고 plasmid를 분리 -분리된 plasmid를 다시 제한효소 처리하여 insert DNA가 삽입되었는지 확인 Ⅱ. Polymerase Chain Reaction 본문 제한효소에 의해 잘린 DNA들을 분리한다. 2. Principle 1) agarose gel electrophoresis 시 DNA의 이동에 영향을 주는 요인들 a. DNA 분자의 크기가 클수록 느리게 이동한다. b. Agarose의 농도가 높을수록 느리게 이동한다. c. DNA 형태에 따라 이동속도가 다르다. 일반적으로 supercoiled DNA > linear DNA > open circular DNA d. 전압이 높을수록 이동속도가 빠르다. e. 전기장의 방향도 이동속도에 영향을 미친다. f. Ethidium bromide는 DNA 이동속도를 15%정도 감소시킨다. g. 전기영동 buffer의 성분과 이온강도도 electrophoresis speed에 영향을 미친다. 2) DNA loading buffer Agarose gel의 well에 DNA를 넣어 줄 때, DNA 용액을 무겁게 하여 agarose의 홈으로 가라 앉히는 역할을 하며, 그 성분에는 전기 영동시 이동속도가 다른 두 개의 염색시약이 들어 있어, DNA와 같이 전기영동 될 때 DNA가 움직인 정도를 알 수 있게 하는 역할을 한다. 3) Electrophoresis buffer TAE(Tris-acetate EDTA): DNA분자량이 큰 경우, agarose electrophoresis에서 쓴다. TBE(Tris-borate EDTA): DNA분자량이 작은 경우, DNA sequencing에 쓰인다. 3. Reagents Agarose, TAE buffer, etidium bromide, DNA ladder, DNA loading buffer 4. Apparatus Microwave, gel cast, electrophoresis tank 5. Procedure ① 20ml의 1 X TAE 용액에 agarose 0.4g을 섞어서 2%로 만든다. 열을 가하여 완전 용해 시키고 Ethidium bromide를 1mg/ml 농도로 첨가한다. ② 충분히 섞어 젤을 굳히는 판에 붓고 식을 때까지 기다린다. (굳힐 때는 comb를 끼워서 well을 만든다.) ③ 전기 영동 tank에 1 X TAE를 넣은 후 gel을 넣는다. (이 때 TAE buffer는 gel이 살짝 잠길 정도로 붓는다.) ④ 2 µl의 100bp DNA ladder를 loading하여 DNA size marker로 사용한다. ⑤ 확인하고자 하는 plasmid DNA를 차례로 DNA loading buffer(1 µl)와 섞은 후, 각각의 well에 loading한다. ⑥ 75V 전압에서 전기영동을 하여, DNA가 충분히 분리되도록 한다. (Loading buffer의 이동위치 관찰) 본문내용 수요일 18:10 - 18:45 2010. 11. 11. 목요일 19:0022:30 2010. 11. 12. 금요일 19:0023:30 Subject Ⅰ. DNA sub-cloning 1. 첫째 날 -Restriction enzyme 처리 -Gel electrophoresis(전기영동으로 FabG DNA와 pET-14b vector 확인) -Gel purification으로 insert gene 분리 2. 둘째 날 -Ligation (pET-14b + FabG) -Competent Cell 만들기 -Heat-Shock을 이용한 Transformation -LB agar plate에 도말 3. 셋째 날 -Transformant 확인 -LB broth에서 증식시킴 4. 넷째 날 -Plasmid mini